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                    客觀日本

                    只需唾液!可同時檢測流感病毒和新冠病毒的試劑盒

                    2021年06月03日 產學研合作

                    隅田 泰生

                    日本SUDx-Biotec公司代表董事兼鹿兒島大學研究生院理工學研究科教授

                    隅田泰生

                    概要

                    SUDx-Biotec公司是為了將2003年10月至2006年9月由本人擔任國立研究開發法人科學技術振興機構(JST)“糖芯片實用化” 預創業項目帶頭人期間所取得的成果轉化成產品而成立的鹿兒島大學初創企業,也是JST扶持創辦的第51家初創企業。

                    細胞表面存在名為糖鏈的、含有豐富信息的納米尺寸鏈狀糖。糖鏈通過與特定的蛋白質或者其他糖鏈的相互作用向細胞傳遞信息來參與免疫等生命活動。另外科學家還發現,糖鏈與細胞的癌變和病毒感染等也有關系,因此糖鏈在生命科學領域頗受關注。不過,研究糖鏈需要在分子水平進行研究,獲得結構明確的糖鏈也需要花費大量的人力和費用,因此研究常常無法順利推進。

                    為解決這個問題,并推進糖鏈科學研究的飛躍進步,我們開發出了將結構明確的糖鏈固定到納米級金屬(金)芯片上的生物器件“糖芯片”和“糖鏈固定化金納米顆?!眱煞N工具,并利用這兩種工具成功捕獲、濃縮及純化了病毒顆粒。我們還通過與PCR(聚合酶鏈反應)相結合的手法,成功開發出了高精度快速檢測流感病毒、諾如病毒、皰疹病毒及豬流行性腹瀉病毒等人與家畜罹患的病毒性疾病的診斷方法。另外,針對2020年世界大流行的新冠病毒(SARS-CoV-2),我們還開發出了采用該技術的體外診斷試劑盒,2020年6月SUDx SARS-CoV-2 detection kit被納入醫保,10月份,能以唾液為樣本無侵襲同時檢測新冠病毒和流感病毒的SGNP nCoV/FluPCR檢測試劑盒通過了藥械審批,并于2020年12月開始上市銷售。

                    關于流感診斷

                    戴口罩、洗手、避免去人多的地方、接種疫苗、提高免疫力等,我們從小就學過的這些與新冠對策基本相同的流感預防對策,盡管如此每年還是會發生流感,所以我們就想應該把自己的技術用于檢測試劑盒上。

                    流感的診斷在日本一般通過基于免疫層析法的抗原蛋白檢測法來進行。不過,這種方法的靈敏度不夠高,很多時候必須發病24小時后才能被確診為陽性。另外,檢測樣本主要使用含有大量病毒抗原、但具有侵襲性的鼻拭子。不少人都有過做流感檢查時體驗了一番苦痛后,被告知為陰性,后來又病情加重的痛苦經歷,甚至有人因此留下了心理陰影,不愿意再接受檢查,結果因為沒有服用抗流感藥物而使得病情加重。

                    為解決這個問題,我們開發了“無痛且超靈敏”的檢測法。在公司官網上還發布了相關視頻(利用唾液的無痛流感PCR檢測),雖然最好的了解方法就是直接去看視頻,我這里就只簡單地為大家介紹一下。

                    細胞表層由于被糖鏈覆蓋,所以病毒看不到細胞表層的蛋白質。因此,病毒首先會吸附到糖鏈上,然后,將糖鏈作為真正的受體(流感的受體是含唾液酸的糖鏈)入侵感染細胞。如圖1所示,我們首先利用糖芯片確定了病毒吸附的糖鏈,并將糖鏈固定到比病毒還小的金納米顆粒上,制備了SGNP(糖鏈固定化金納米顆粒)。將SGNP加入病毒溶液中,SGNP會吸附到病毒上捕獲病毒。被捕獲的病毒會變重,即使利用低速離心機也能獲得含病毒顆粒的沉淀物。通過向沉淀物中加入少量表面活性劑溶液,或者加水加熱,可以破壞病毒顆粒,析出里面的RNA(核糖核酸)。收集病毒顆粒時會進行粗提純,因此析出的RNA擁有足夠的純度,可直接用于RT-PCR(逆轉印聚合酶鏈反應)來檢測病毒RNA。如果使納米顆粒擁有磁性的話還可以進行磁性分離,我們針對這種情況開發了添加誘導材料磁性微顆粒的方法,拿到樣本后只需3分鐘左右即可制作出用于RT-PCR的RNA溶液。

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                    圖1:采用糖鏈固定化納米顆粒的高靈敏度病毒檢測法:捕獲、濃縮及純化病毒顆粒

                    表1是我們的檢測法首次實施臨床研究時的部分結果。這是在鹿兒島市內的小型醫院或大學附屬醫院利用疑似流感患者的鼻拭子和快速檢測試劑盒(免疫層析法)檢測時獲得的結果,以及從相同患者身上采集約0.5mL唾液,通過SGNP法提取RNA并用RT-PCR法檢測(以下簡稱SGNP/PCR法)時獲得的結果。比較各種結果可見,SGNP/PCR法的陽性率(靈敏度)遠遠高于前者。令人驚訝的是,快速檢測試劑盒判斷為陰性的疑似流感患者有50%以上都是流感陽性。我們連續實施了約5年的臨床研究,2017年,在厚生勞動省的先進醫療會議上,“通過采用糖鏈納米技術的高靈敏度病毒檢測法為傳染病診療及院內感染對策提供支援”被納入先進醫療A分類。

                    在先進醫療A分類的研究中,主要研究目的是調查此前不清楚的、SGNP/PCR法與快速檢測試劑盒相比性能尤其優異的發病后時間段。2018~2019年的流感季在I醫院實施的檢測中,發病后24小時內用快速檢測試劑盒檢測呈陰性的46名疑似流感患者有17人分別在唾液中檢測出了甲型(9人)、乙型(7人)和甲+乙型流感病毒(復合感染1人)。而在M醫院,194名疑似流感患者中有64人(甲型53人、乙型9人、復合感染2人)從唾液中檢測出了流感病毒。這表明,SGNP/PCR法即使發病時間不到24小時,也能準確檢測出流感患者。另外,將30位患者的唾液稀釋液用于采用MDCK細胞的病毒分離培養實驗發現,精度(陽性一致率,13/13)和特異性(陰性一致率,17/17)均完全相同,這表明SGNP/PCR法是可以檢測感染性病毒的方法。

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                    表1:2011-2012年流感季實施的臨床研究的結果:利用疑似流感患者鼻拭子的快速檢測試劑盒的檢測結果與利用唾液的SGNP/PCR法的檢測結果比較

                    根據以上結果,我們與獨立行政法人醫藥品醫療機器綜合機構(PMDA)協商后,實施了臨床性能試驗。作為以患者唾液為樣本的SGNP/PCR法的對照試驗,由于此前獲批的流感體外診斷藥物沒有以唾液為樣本的例子,因此決定利用來自相同患者鼻腔分泌物的MDCK細胞進行病毒分離培養。很多論文和報告都顯示鼻腔分泌物中含有的病毒量更多,因此一直擔心該比較試驗能否獲得90%以上的一致率,2019年12月,我們邀請鹿兒島市內的四家診所和醫院配合,啟動了臨床性能試驗。受新冠疫情影響,從2020年3月開始基本再沒收集到樣本,經PMDA批準,我們比較了病例等數據全部齊全的463名患者的樣本數據。幸運的是,臨床性能試驗成功結束,精度達到93%,特異性達到95%,整體的一致率達到95%

                    關于新冠病毒檢測

                    2020年2月,先進醫療A類研究的聯合研究人員田島醫生所在的濱松醫療中心收治了一位新冠患者。我們雖然沒有處理人類冠狀病毒的經驗,但知道豬類冠狀病毒(豬流行性腹瀉病毒)與流感病毒一樣,也可以利用SGNP濃縮,因此與田島醫生商量后啟動了SARS-CoV-2的臨床研究。田島醫生采集了患者的唾液和咽拭子或者鼻咽拭子2種樣本,咽拭子或鼻咽拭子按照國立感染癥研究所制定的操作規范,利用Qiagen法在濱松環境保健中心提取RNA,實施了PCR檢測。而唾液利用流感檢測試劑盒濃縮病毒后,提取RNA送到了鹿兒島,我們對美國CDC(疾病控制與預防中心)和國立感染癥研究所推薦的引物和探針進行部分改良后實施了PCR檢測。檢測結果顯示,這位患者在住院第35天時唾液中依然存在SARS-CoV-2,唾液轉為陰性后,鼻咽拭子也轉為陰性,最終在第42天出院。這項研究表明,使用早上剛起床時的唾液作為樣本,可以獲得與鼻咽拭子相同的結果。

                    之后我們利用在濱松醫療中心做過檢測的疑似新冠患者的唾液和鼻咽拭子繼續進行臨床研究。并將濱松醫療中心的鼻咽拭子檢測結果作為對照試驗,評估了SGNP/PCR法。結果顯示,利用鼻咽拭子時,精度(10/10)和特異性(15/15)均100%一致,利用唾液時,精度(9/10)90%一致,特異性(15/15)100%一致。這些結果提交給厚生勞動省后,最終作為獲得緊急使用授權的研究試劑“SUDx SARS- CoV-2 detection kit”于2020年6月10日被納入醫保。

                    藥械申請

                    由于“SUDx SARS- CoV-2 detection kit”的流感臨床性能試驗精度和特異性均超過90%,因此2020年6月24日向PMDA咨詢藥械(關于確保藥品和醫療器械等的品質、有效性及安全性等的法律:《藥械法》)申請相關事宜時得到的意見是:463個病例均無問題,可以申請。在剩下的時間里,我們又向PMDA報告說目前正考慮開發可與上述被納入醫保的新冠病毒檢測試劑盒組合,利用唾液同時檢測流感和新冠的檢測系統,PMDA聽后建議,為應對2020年的流感季,最好先對同時檢測系統進行藥械申請。于是,在約2周后的全面咨詢中,我們向PMDA報告了采用人工模擬樣本的方案,得到了PMDA的同意,人工模擬樣本是將滅活SARS-CoV-2以及甲型和乙型流感的陽性對照物與唾液混合制備的。厚生勞動省的相關人員也參加了那次咨詢,希望我們考慮量產事宜。

                    我們選出同時檢測3種病毒的酶、探針及多重色素等之后,利用120份人工模擬樣本進行了試驗,并對每份模擬樣本分別實施了新冠、甲型流感和乙型流感檢測,作為對照試驗進行了評估。結果顯示,精度(105/105)和特異性(15/15)均達到100%。整理這些結果后,于9月份為“SGNP nCoV/Flu PCR檢測試劑盒”進行了藥械申請。另外,不僅是唾液,還利用混合鼻拭子及鼻咽拭子的人工模擬樣本進行了試驗,最終,作為以唾液、鼻拭子或者鼻咽拭子為樣本,可同時檢測新冠和流感的體外診斷藥物于10月23日通過了藥械審批,之后于11月10日完成定價,納入了醫保。

                    我們的試劑盒是唯一可以利用唾液同時檢測流感和新冠,目前應該還沒有其他同類試劑盒正式獲批。唾液是不會給患者造成痛苦和不適的樣本,而且可以根據醫生的在線指導自我采集。

                    避免出現假陽性的檢測方法

                    由于SGNP/PCR法首先收集病毒顆粒,因此我們認為利用該方法檢測得到的病毒量可以解釋患者的病況。為證明這一點,我們對新冠病毒住院患者實施了后續實驗。參考上述濱松醫療中心的例子,請鹿兒島市內的T醫院采集住院患者早上剛起床時的唾液,并與SUDx SARS-CoV-2 detection kit的樣本稀釋保存液混合,在4℃下保存。之后我們利用Qiagen法(Boom法)從該溶液中提取和純化SARS-CoV-2的RNA,再利用SGNP法收集病毒顆粒,提取RNA,然后利用相同的RT-PCR試劑和PCR檢測儀,按照相同的操作規范進行檢測,并作為原始溶液中的病毒濃度進行了定量。

                    請看下面兩個病例。如圖2所示,患者TCH-59住院第二天時,利用SGNP法(圖中藍條)和Qiagen法(圖中灰條)均檢測出唾液中存在高濃度的RNA,SGNP法在住院第五天時檢測到的RNA濃度略有升高,但整體仍呈逐日下降的趨勢,到第六天以后已經完全檢測不到。而Qiagen法檢測的RNA濃度在住院前十天基本沒有變化?;颊叩牟∏橹鹑蘸棉D,到第七天時已經完全沒有癥狀?;颊逿CH-61住院第二天時利用SGNP法檢測出非常少量的RNA,而利用Qiagen法沒有檢測出。原因應該是,單純計算的話,SGNP法將樣本濃縮了25倍,而Qiagen法只濃縮了約2.5倍。第三天SGNP法的檢測結果沒有變化,但第四天RNA濃度開始升高。Qiagen法第三天檢測到了RNA,第四天檢測到的RNA濃度也與前一天基本相同。第五天和第六天是周末,所以沒采集到樣本,第七天SGNP法和Qiagen法檢測到的RNA濃度均升高,之后這位患者的病情惡化,被轉去了??漆t院。

                    如患者TCH-59那樣,由于Qiagen法無法區分病毒片段中的RNA和病毒顆粒中的RNA,康復期的患者進行PCR檢測時會出現假陽性,可能引起混亂。因此,住院患者好像基本不做PCR檢測。即使不檢測,如果像患者TCH-59那樣,住院10天且已經沒有任何癥狀,患者也可以出院。另一方面,患者TCH-61利用Qiagen法和SGNP法都獲得了可以預測病情惡化的數據。以上結果表明,像SGNP法那樣,檢測結果與病情吻合的PCR檢測法非常有效。除此之外還有很多病例,目前正在整理論文。在所有病例中,利用SGNP法量化的RNA都比Qiagen法更能解釋病情的康復情況,有望進一步降低假陽性檢測。

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                    圖2:COVID-19住院患者(TCH-59和TCH-61)的后續臨床研究
                    唾液樣本的PCR預處理法的比較(藍色為SGNP法;灰色為Qiagen法)

                    結束語

                    SGNP法作為PCR檢測的預處理法,具有簡單快速的優點,由于濃縮了病毒顆粒,可實現靈敏度高且能準確反應病情的PCR檢測法,尤其是處于康復期的患者,還利用該方法發現了有望盡快回歸職場的病例。舉辦東京奧運會和殘奧會時,如果有運動員感染,這應該是一種有效的檢測方法。

                    為應用于樣本數量較少但需要快速出結果的情況,我們目前正在開發支持Multipelx的高速PCR檢測儀。另外,還打算開發SGNP法的自動樣本處理裝置。

                    日語發布原文

                    文:隅田泰生(日本SUDx-Biotec公司代表董事兼鹿兒島大學研究生院理工學研究科教授)
                    原載自《產學官合作月刊》,2021年5月號
                    翻譯編輯:JST客觀日本編輯部